Charakter aktivity:  Nezávislý výskum a vývoj

Žiadateľ: ÚEF SAV, Košice

 

Cieľ aktivity:  

Cieľom aktivity je naviazať na nanočastice komerčne dostupné kortikosteroidy (napr. dexametazón, hydrokortizón) a vírusový spike protín (S-proteín), tak, aby mohol byť využitý ako jedna z intervencií pri vývoji biomodelu pre sledovanie komplikácií spojených s COVID-19. S-proteín vykonáva dve hlavné úlohy, ktoré pomáhajú pri infekcii hostiteľa: 1) sprostredkúva väzbu medzi vírusom a povrchovými receptormi hostiteľskej bunky a 2) uľahčuje vstup vírusu do hostiteľskej bunky tým, že pomáha pri fúzii vírusu a membrány hostiteľských buniek (https://www.raybiotech.com/covid19-proteins/).

Ďalším cieľom tejto aktivity je vybrať nanočastice pre nanoenkapsuláciu liečiva/látky, ktorá bude testovaná v Aktivite 3 na vybranom biomodeli. Z  dostupnej literatúry a opisu komplikácií pacientov s COVID-19 je známe, že u nich dochádza k poškodeniu pľúc. Podľa Britskej intenzivistickej spoločnosti vo včasnej fáze zlyhávania dýchania sú postihnuté kapiláry, v ktorých vzniká mikrotrombóza. Aktivuje sa hemokoagulačný systém, zvyšuje sa fibrinolýza a zhoršuje sa perfúzia. Neskôr zlyhávanie dýchania ovplyvňuje rozvoj klasického ARDS často s baktériovou pneumóniou. Zameriame sa preto na prípravu nanočastíc, ktoré sa prednostne vychytávajú v pľúcach, aby liečivo na ne naviazané poskytlo pacientom rýchlu úľavu.

Cieľ 4.1 Návrh vhodného nosiča pre navrhnuté liečivo  

Cieľ 4.2  Návrh a výber najvhodnejšej metódy enkapsulácie liečiva/proteínu  

Cieľ 4.3  Príprava nanonosiča s enkapsulovaným liečivom/proteínom  

Cieľ 4.4  Komplexná fyzikálno-chemická charakterizácia nanonosiča s enkapsulovaným liečivom/proteínom

 

Opis výskumno-vývojovej aktivity projektu:  

Polymérne Nanonosiče (PNC) sú koloidné častice veľkosti od 10 do 1000 nm s optimálnou veľkosťou  od 10 do 200 nm, v ktorých môžu byť  biologicky účinné  molekuly uväznené, rozpustené, a/alebo enkapsulované. Veľkosť a povrchové charakteristiky nanočastíc, ako náboj, hydrofilná-hydrofóbna rovnováha a prítomnosť špecifických  zložiek významne ovplyvňujú ich distribúciu v organizme. Použitie biodegradovateľných materiálov redukuje problémy spojené s elimináciou materiálov po uvoľnení liečiva. Okrem toho  biodegradabilné matrice môžu predstavovať ďalší spôsob kontroly rýchlosti uvoľňovania spojením typických difúznych mechanizmov s naladiteľnou degradáciou polyméru.PNCs môžu byť pripravené viacerými technikami, v závislosti na povahe polymérneho materiálu a vlastnostiach liečiva, ktoré má byť zabudované.  

Pripravené polymérne nanočastice s uzavretým liečivom budú detailne charakterizované rôznymi metódami dostupnými v laboratóriách ÚEF SAV.  Morfológia a štruktúra nanočastíc bude pozorovaná TEM a SEM mikroskopiou. Rozmerová distribúcia  pripravených vzoriek bude meraná metódou dynamického rozptylu svetla a diferenciálnej centrifugačnej  sedimentácie. Povrchové vlastnosti a stabilita budú monitorované meraním zeta potenciálu.  Účinnosť inkorporácie liečiva, t.j .zabudovanie liečiva bude meraná dostupnými analytickými  metódami (UV-VIS a IČ spektrofotometriou).   Pripravené polymérne nanočastice s optimálnou distribúciou veľkostí hydrodynamického priemeru budú následne podrobené gélovej chromatografii s cieľom vyselektovať frakcie s rovnakou veľkosťou. Veľkosť nanočastíc a ich interakcia s bunkami bude sledovaná aj pomocou atómového silového mikroskopu. Polymérne nanočastice s vhodnými fyzikálno-chemickými parametrami budú inkubované s bunkami rôznych línií ako napr. ľudské epiteliálne bunky pľúc A549, či obličiek. Po ukončení inkubácie bude študovaná cytotoxicita pripravených nanočastíc prostredníctvom stanovenia viability a prežívania buniek pomocou WST-1 a LDH testov. Pomocou optickej a fluorescenčnej mikroskopie bude sledovaný tzv. uptake, to znamená príjem nanočastíc bunkami.     

 

Základné míľniky výskumnej aktivity:  

Míľnik M4.1 Výber vhodného nosiča, ktorý bude spĺňať požiadavky uvedené v Aktivite 3  

Míľnik M4.2 Výber vhodnej metódy imobilizácie/konjugácie modelového liečiva/proteínu na nanonosiče  

Míľnik M4.3 Optimalizácia procesu enkapsulácie liečiv na báze kortikosteroidov/proteínudo nanonosičov  

Míľnik M4.4 Výber metód hodnotenia pripravených nanosičov z hľadiska účinnosti enkapsulácie liečiva/proteínov a stability pripravených nanočastíc  

Míľnik M4.5 Zbieranie dát, vyhodnocovanie experimentov a písanie článkov  

 

Základné výsledky výskumnej aktivity:

Výsledok V4.1 Na základe štúdia odbornej literatúry a fyzikálnochemickej charakterizácie komerčne dostupných polymérov budú vybrané a otestované  polyméry na základe vlastnosti modelového liečiva a cielenej biodistribúcie samotných nanonosičov.  

Výsledok V4.2 Podľa výsledkov účinnosti zabudovania liečiva vyberieme vhodnú metódu enkapsulácie liečiva / naviazania proteínu.  

Výsledok V4.3 Výberom organickej fázy, pomerom organickej a vodnej fázy, zmenou pH     vodnej fázy a rýchlosťou miešania sa bude optimalizovať proces zabudovania modelového liečiva do polymérnych nanosfér  

Výsledok V4.4 Na základe použitých analytických metód bude stanovená účinnosť inkorporácie liečiva do nanočastíc